Assessment of the granulosis virus of Cydia pomonella L. (CpGV) as a tool to control the pea moth Cydia nigricana F. in grain peas

C. nigricana verursachte in den letzten Jahren erhebliche Schäden in der Gemüseerbsenproduktion. Da es bisher im ökologischen Anbau keine wirksame Regulierungsoption für C. nigricana gibt, sollte die Direktbekämpfung mit dem Apfelwicklergranulosevirus (CpGV) geprüft werden. Payne (1981) stellte bereits in Laborversuchen eine Empfindlichkeit von C. nigricana gegen das Apfelwicklergranulosevirus CpGV fest, der LC50 Wert von CpGV gegen Erstlarven lag hierbei bei Fraßtests im Labor bei der 10-fachen Konzentration gegen C. pomonella (1,90 × 105 im Vergleich zu 1,54 × 104 Partikel/ml). Geissler (1994) erreichte in Freilandversuchen durch den Einsatz des Virus Befallsreduktionen von 72% mit den im Apfelanbau üblichen Konzentrationen.In Germany pea moth (Cydia nigricana, Lepidoptera: Tortricidae) is a serious problem especially for organic vegetable peas. CpGV is a natural virus causing death in Cydia pomonella. The virus does not act by contact, but ingestion. Small scale field-tests with CpGV were conducted according to EPPO-guidelines with grain pea cv. "Santana" in a randomised block design in 4 replicates. At the time of egg hatching peas were sprayed with CpGV. Efficacy assessments were based on the percentage of damaged peas, the numbers of larvae per pod, larval stage and yield loss. In 2004 an UV-protection powder combined with CpGV was tried unsuccessfully. Even very high application rates of CpGV did not result in a significant reduction of pea moth larvae in the pods, rendering CpGV not useful for their control under the conditions tested

Light microscopic studies on the development of Beauveria bassiana and other putative endophytes in leaf tissues

Die vorliegende Untersuchung beinhaltete sechs Testpilze, über die in der Literatur Berichte als Endophyten vorliegen (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea, Trichoderma harzianum, Fusarium proliferatum, Chaetomium globosum), zwei phytopathogene Pilze (Ascochyta fabae, Plenodomus lingam) und vier Wirtspflanzen (Vicia faba, Brassica napus, Phaseolus vulgaris, Zea mays). Die Konidien oder Blastosporen bzw. Ascosporen der Testpilze wurden durch Sprühen auf die Blatt­ober­fläche oder durch Infiltration durch die Spaltöffnungen appliziert. Die lichtmikroskopische Untersuchung zeigte, dass die Sporen auf der Blattoberfläche auskeimten, aber nicht aktiv in die Blätter eindrangen. Im Blatt­inneren schienen Sporenkeimung und Hyphenwachstum auf Bereiche mit Zell- bzw. Gewebeschädigung beschränkt zu sein. Verschiedene Wirtsreaktionen wurden beobachtet, wie die Verbräunung von Epidermiszellen und die Bildung von Papillen. Eine Besiedlung des Gewebes vergleichbar der mit den Pathogenen A. fabae (bei Ackerbohne) und P. lingam (bei Raps) wurde nicht beobachtet. Erst nach Auslegen von inokuliertem Blattmaterial auf Agarmedium setzten Sporenkeimung und Hyphenwachstum im Blattinneren ein. Die Ergebnisse deuten eher auf eine saprotrophe als auf eine endophytische Lebensweise der untersuchten Pilze im Blattgewebe der untersuchten Wirtspflanzen hin.The study involved six test fungi previously recorded in the literature as being endophytes (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea, Trichoderma harzianum, Fusarium proliferatum, Chaetomium globosum), two plant pathogenic fungi (Ascochyta fabae, Plenodomus lingam) and four host plants (Vicia faba, Bras­sica napus, Phaseolus vulgaris, Zea mays). Aerial conidia, blastospores, or ascospores, respectively were applied to leaf surfaces by spraying or by infiltrating spore suspensions through stomata directly into the leaves. Obser­vations using light microscopy showed that the test fungi germinated on the leaf surface but did not enter actively into the leaves. Within the leaves, germination of spores and growth of hyphae appeared to depend on the presence of damaged plant tissue. Various host reactions such as browning of epidermal cells and formation of papillae were observed. Colonization of healthy leaves by the test fungi in a manner similar to the pathogens A. fabae (on Faba bean) and P. lingam (on oilseed rape) was not observed. Spore germination and hyphal growth commenced when inoculated leaves were placed on agar medium. The results indicate that the test fungi possessed a saprotrophic rather than an endo­phytic life style when associated with leaf tissue of the studied hosts

Biology of the black rot pathogen, Guignardia bidwellii, its development in susceptible leaves of grapevine Vitis vinifera

Seit 2002 / 2003 tritt die durch den Ascomyceten Guignardia bidwellii hervorgerufene Schwarzfäule regelmäßig in ökologisch bewirtschafteten Weinbergen an Mosel, Nahe und im Mittelrheintal auf. Obwohl die Krankheit, ursprünglich aus den USA kommend, schon seit über 100 Jahren in Südeuropa bekannt ist, ist das Wissen über die Biologie von G. bidwellii noch immer lückenhaft. In der vorliegenden Arbeit wird der Lebenszyklus von G. bidwellii mit histologisch-mikroskopischen Methoden (Durchlicht-, Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie) untersucht. Die Entwicklung des Pilzes in einer anfälligen Rebsorte (Riesling) wird von der Sporenkeimung bis zur Ausbildung der Pyknidien und Pseudothezien verfolgt. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Entwicklung nach dem Eindringen in den Wirt, die durch subcuticuläres Wachstum charakterisiert ist. Ziel ist die Verbreiterung der Wissensbasis über die Biologie von G. bidwelli sowie die Erarbeitung einer Grundlage für die Entwicklung effizienter Bekämpfungsmethoden und eine histologische Charakterisierung der Sortenresistenz.Since 2002 / 2003 black rot caused by Guignardia bidwellii is regularly occurring in organic viticulture in the wine growing areas at the Mosel and Nahe River and in the Middle Rhine valley in Germany. Though the disease originates from the USA and is known in Europe already for more than 100 years, the knowledge about the biology of its causal organism is still scanty. In the present study the life cycle of G. bidwellii is analysed with histological microscopical methods (bright field, phase contrast, fluorescence and electron microscopy). The development of the fungus on a susceptible grapevine variety (Riesling) is followed from spore germination up to the development of pycnidia and pseudothecia. The study is focused on the phase after penetration of the fungus which is characterized by subcuticular spread. The aim is to broaden the knowledge of the biology of G. bidwellii, to provide the basis for efficient control measures and to enable the histological characterization of varietal resistance

In situ immunofluorescence localization: A method for rapid detection of Beauveria spp. in the rhizosphere of Quercus robur saplings

Zur biologischen Bekämpfung von Pflanzenschädlingen, z.B. Maikäfer-Engerlingen, in der Rhizosphäre von Eichen, Apfelbäumen oder Kiefern werden zunehmend entomopathogene Beauveria-Spezies eingesetzt. Für eine erfolgreiche Anwendung ist es wichtig, die Ausbreitung und Persistenz der ausgebrachten Pilze qualitativ und quantitativ zu erfassen. Die Bestimmung beider Größen durch Ausplattieren auf selektiven Nährmedien oder durch mole­kulare Methoden wie PCR ist mühsam und oft ungenügend. Ziel der vorliegenden Studie war daher, eine spezifische In-situ-Methode durch Immunfluoreszenzmarkierung von Beauveria spp. zu entwickeln, hier an jungen Feinwurzeln dreijähriger Stieleichen. Durch Anfärben mit dem unspezifischen Farbstoff Blankophor wurde sichtbar, dass alle untersuchten Feinwurzeln ein dichtes Netz von Bodenpilzen trugen. Polyklonale Beauveria-Antikörper markierten an nicht beimpften Wurzeln keinen dieser natürlich wachsenden Pilze. Mit Beauveria brongniartii beimpfte Wurzeln zeigten bis zu zehn Monate nach der Inokulation eine spezifische Markierung. Während die natürlich vorkommenden Rhizosphären-Pilze in den Interzellularräumen der Wurzelrinde wuchsen, waren Hyphen von inokulierter B. brongniartii nie im Wurzelgewebe zu finden, sondern nur oberflächlich auf der Rhizodermis. Diese Beobachtungen zeigen, dass B. brongniartii bei Eichenwurzeln nicht endophytisch wächst, und dass die verwendete Methode die Unterscheidung von B. brongniartii von der in der Eichen-Rhizosphäre lebenden Pilzflora ermöglicht. Immunfluoreszenzmarkierung, wie in der aktuellen Studie eingesetzt, kann eine nützliche Methode sein, um B. brongniartii in der Rhizosphäre nachzuweisen und quantitativ zu erfassen und somit eine Langzeitkontrolle von Schädlingen mit Entomopathogenen zu ermöglichen.For biological control of plant pests, e.g. cockchafer grubs, in the rhizosphere of oak, apple or pine trees, ento­mopathogenic Beauveria spp. are increasingly applied. For successful use, it is important to monitor the spread and persistence of the inoculated fungi, both qualitati­vely and quantitatively. The determination of both para­meters by plating on selective nutrient media or by mole­cular methods such as PCR of soil samples are quite laborious and often do not yield satisfactory results. Therefore, the aim of the present study was to develop a spe­cific in situ method using immunofluorescence labelling of Beauveria spp. growing on young fine roots of three-year old oak saplings. All fine roots investigated were covered with a dense net of soil rhizosphere fungi, as visua­lized by staining with the nonspecific dye blankophor. On non-inoculated roots, polyclonal Beauveria anti­bodies did not label any of these naturally growing fungi. Only samples of roots inoculated with Beauveria brongniartii displayed specific labelling up to ten months after inocu­lation. Whereas the natural rhizosphere fungi were detected growing in the intercellular space of the root cortex in an ectomycorrhiza-like manner up to the endodermis, hyphae of the inoculated B. brongniartii were never seen within the root tissue but only growing on the surface of the rhizodermis. These observations indicate that B. brongniartii does not grow endophytically, and that the method used allows to discriminate B. brongniartii from the resident fungal flora in the oak tree rhizosphere. Detection by immunofluorescence labelling employed in the current study may be a useful tool to follow B. brongniartii in experiments aimed at establishing the entomopathogen in the rhizosphere and to monitor its fate in long-term control of entomopathogens

Detection and growth of endophytic entomopathogenic fungi in dicot crop plants

Der Nachweis und die Verbreitung pilzlicher Endophyten in Pflanzen wird üblicherweise durch Re-Isolierung auf Agarmedien oder durch PCR-Techniken erbracht. Histologische Untersuchungen zur Kolonisierung der Wirtspflanze liegen dagegen nur selten vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die Entwicklung von entomopathogenen Pilzen auf der Pflanzenoberfläche und innerhalb des Gewebes durch Licht- und Fluoreszenzmikroskopie von mit verschiedenen Farbstoffen behandelten Blattproben untersucht oder, um die Spezifität der injizierten Endophyten zu gewährleisten, mit primären polyklonalen und sekundären FITC-konjugierten Antikörpern. Diamino­ben­zidin-Tetrahydrochlorid (DAB) diente dem Nachweis von Wasserstoffperoxid als Stresstest.Vier entomopathogene Pilz-Gattungen wurden mit drei phytopathogenen Pilzarten verglichen. Wirtspflanzen waren Raps (Brassica napus), Ackerbohnen (Vicia faba) und Gurken (Cucumis sativus).Auch wenn Blastosporen von Beauveria bassiana in B. napus Blätter infiltriert wurden, schienen sie trotzdem nur auf der Blattoberfläche zu keimen. Die erfolgreiche Pilz-Re-Isolierung aus Blättern von B. napus, die mit B. bassiana, Isaria fumosorosea oder Metarhizium anisopliae inokuliert wurden, bewies ein Überdauern dieser Entomopathogene im Gewebe für mindestens zwei Wochen. Bildung brauner Niederschläge nach der Blattbehandlung mit DAB in Gegenwart von B. bassiana zeigte die Produktion von Wasserstoffperoxid in B. napus an, aber nicht in V. faba. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse eine niedrigere endophytische Kolonisierung, als nach der Literatur zu erwarten, was auf eine geringe Verfügbarkeit von Nährstoffen im pflanzlichen Interzellularraum und die Abwesenheit von Zellwand- und Zell­membran-abbauenden pilzlichen Enzymen als wachstumsbegrenzende Faktoren hindeutet. Daten über die endo­phytische Kolonisierung sollten daher allgemein jeweils durch histologische Nachweise von Art und Ausmaß des Pilzwachstums im Wirtsgewebe unterstützt werden.The presence and distribution of fungal endophytes in plants is commonly assessed by re-isolation on agar media or detection by PCR-techniques. Histological studies on the process of colonization of the host plant have only scarcely been performed. In the present study, the development of entomopathogenic fungi on the plant surface and inside the tissue was examined by light and fluorescence microscopy of leaf samples treated with vari­ous dyes or, to guarantee the specificity of injected endophytes, with primary polyclonal and secondary FITC-conjugated antibodies; diaminobenzidine-tetra­hy­dro­chloride (DAB) was applied as stress test for the detec­tion of hydrogen peroxide. Four species of entomopathogenic fungi were studied and compared with three phytopathogenic fungal species. The host plants were oilseed rape (Brassica napus), faba bean (Vicia faba), and cucumber (Cucumis sativus).When blastospores of selected four fungal species were infiltrated into B. napus leaves they appeared to germinate only on the leaf surface, but not within the mesophyll. Successful re-isolation from B. napus inoculated with B. bassiana, Isaria fumosorosea or Metarhizium anisopliae showed that these entomopathogens were able to persist in the tissue for at least two weeks. Formation of brown precipitates after leaf treatment with DAB in the presence of B. bassiana indicated the production of hydro­gen peroxide by B. napus but not by V. faba. Overall, the results indicate a lower endophytic colonization than could have been expected from the literature, suggesting nutrient availability in the plant intercellular space and absence of cell wall and cell membrane degrad­ing fungal enzymes as fungal growth-limiting factors. It is concluded that data on endophytic colonization should generally be supported by histological evidence of the kind and amount of fungal growth in the host tissue

Electron Microscopy Methods for Virus Diagnosis and High Resolution Analysis of Viruses

The term “virosphere” describes both the space where viruses are found and the space they influence, and can extend to their impact on the environment, highlighting the complexity of the interactions involved. Studying the biology of viruses and the etiology of virus disease is crucial to the prevention of viral disease, efficient and reliable virus diagnosis, and virus control. Electron microscopy (EM) is an essential tool in the detection and analysis of virus replication. New EM methods and ongoing technical improvements offer a broad spectrum of applications, allowing in-depth investigation of viral impact on not only the host but also the environment. Indeed, using the most up-to-date electron cryomicroscopy methods, such investigations are now close to atomic resolution. In combination with bioinformatics, the transition from 2D imaging to 3D remodeling allows structural and functional analyses that extend and augment our knowledge of the astonishing diversity in virus structure and lifestyle. In combination with confocal laser scanning microscopy, EM enables live imaging of cells and tissues with high-resolution analysis. Here, we describe the pivotal role played by EM in the study of viruses, from structural analysis to the biological relevance of the viral metagenome (virome)

Elucidating the genomic history of commercially used Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis strain NB176

Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Btt) produces a coleopteran-specific crystal protoxin protein (Cry3Aa δ-endotoxin). After its discovery in 1982, the strain NB125 (DSM 5526) was eventually registered in 1990 to control the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata). Gamma-irradiation of NB125 resulted in strain NB176-1 (DSM 5480) that exhibited higher cry3Aa production and became the active ingredient of the plant protection product Novodor® FC. Here, we report a comparative genome analysis of the parental strain NB125, its derivative NB176-1 and the current commercial production strain NB176. The entire genome sequences of the parental and derivative strains were deciphered by a hybrid de novo approach using short (Illumina) and long (Nanopore) read sequencing techniques. Genome assembly revealed a chromosome of 5.4 to 5.6 Mbp and six plasmids with a size range from 14.9 to 250.5 kbp for each strain. The major differences among the original NB125 and the derivative strains NB176-1 and NB176 were an additional copy of the cry3Aa gene, which translocated to another plasmid as well as a chromosomal deletion (~ 178 kbp) in NB176. The assembled genome sequences were further analyzed in silico for the presence of virulence and antimicrobial resistance (AMR) genes